Ben Willing, Jonas Halfvarson, Johan Dicksved, Magnus Rosenquist, Gunnar Järnerot, Lars Engstrand, Curt Tysk, Janet K. Jansson, Los estudios de gemelos revelan desequilibrios específicos en la microbiota asociada a la mucosa de pacientes con enfermedad de Crohn ileal, Enfermedades inflamatorias intestinales, Volumen 15, Número 5, 1 de mayo de 2009, páginas 653-660, https://doi.org/10.1002/ibd.20783
Fondo
La gran variación interindividual en la composición de la microbiota intestinal entre individuos no emparentados ha dificultado la identificación de aspectos específicos de la disbiosis que conducen a la enfermedad de Crohn (EC).
Métodos
Para reducir las variaciones en la exposición durante el establecimiento de la flora intestinal y la influencia del genotipo, estudiamos la microbiota asociada a la mucosa de pares de gemelos monocigóticos que eran discordantes (n = 6) o concordantes (n = 4) para la EC. El ADN se extrajo de biopsias recogidas en 5 localizaciones entre el íleon y el recto. Se amplificaron los genes de ARN ribosómico 16S bacteriano y se evaluó la composición de la comunidad mediante polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal, clonación y secuenciación, y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real.
Resultados
Las composiciones microbianas en todos los lugares de biopsia de cada individuo fueron similares, independientemente del estado de la enfermedad, pero hubo diferencias entre los individuos. En particular, los individuos con EC predominantemente ileal tuvieron una abundancia dramáticamente menor (P < 0.001) de Faecalibacterium prausnitzii y una mayor abundancia (P < 0.03) de Escherichia coli en comparación con los gemelos sanos y aquellos con EC localizada en el colon. Esta disbiosis se correlacionó significativamente con el fenotipo de la enfermedad más que con el genotipo.
Conclusiones
La reducción de la abundancia de F. prausnitzii y el aumento de la abundancia de E. coli son indicativos de un fenotipo de EC ileal, distinto de la EC colónica, y las abundancias relativas de estas poblaciones bacterianas específicas son candidatos prometedores a biomarcadores para el diagnóstico diferencial de la EC y, finalmente, para el tratamiento personalizado.
Definir la etiología de la enfermedad de Crohn (EC) ha resultado difícil debido a la complicada interacción de factores ambientales y genéticos que conducen al desarrollo de la enfermedad. Cada vez hay más pruebas de que la EC es, en última instancia, el resultado de una ruptura de la relación de distensión entre las bacterias comensales del intestino y el sistema inmunitario del huésped. 1,2 Una tasa de concordancia de la enfermedad del ≈50% en gemelos monocigóticos 3 identifica a la genética como un factor importante que contribuye al desarrollo de la EC. Sin embargo, una tasa de discordancia igual en gemelos monocigóticos3 apunta a la importancia de los factores ambientales, incluida la composición de la microbiota intestinal.
La hipótesis actual es que la estimulación antigénica suficiente para causar la enfermedad es proporcionada por un desequilibrio de organismos comensales beneficiosos y perjudiciales o “disbiosis”. 4,–6 Informes recientes indican un aumento de la abundancia de Bacteroides7 y Enterobacteriaceae,8,–10 particularmente Escherichia coli,11 y una reducción en la diversidad microbiana12,–14 en CD. Sin embargo, hasta la fecha no se ha indicado de forma convincente ninguna especie bacteriana como biomarcador de la EC. Dado que el genotipo del huésped desempeña un papel importante en la configuración de la población microbiana, como lo demuestran las similitudes en los gemelos monocigóticos,15,-17 no está claro si el desequilibrio microbiano está asociado con el genotipo del huésped o con la enfermedad. Esto se puede aclarar mediante el estudio de pares de gemelos monocigóticos que son discordantes (1 está sano y 1 está enfermo) para la enfermedad.
La microbiota de la mucosa difiere de la de la digesta,18,19 y es de especial interés porque la superficie de la mucosa es el lugar de reconocimiento microbiano por parte del huésped que, si no se regula adecuadamente, podría dar lugar a las respuestas inflamatorias típicas de la EC. 20,21 Por lo tanto, estudiamos muestras de biopsia recogidas en colonoscopia de pares de gemelos monocigóticos previamente estudiados22 que eran discordantes o concordantes para EC. Nuestra hipótesis era que el estudio en profundidad de gemelos monocigóticos discordantes utilizando una combinación de enfoques moleculares facilitaría la identificación de bacterias específicas que se correlacionan con la incidencia de EC en lugar del genotipo del huésped, incluidas las que aún no se han cultivado.
Materiales y métodos
Sujetos humanos
Se estudiaron un total de 10 pares de gemelos monocigóticos obtenidos de una población de gemelos suecos previamente descrita3: 2 pares discordantes para EC predominantemente ileal (DAI), 4 pares discordantes para EC predominantemente colónica (DCC), 2 pares concordantes para DAI y 2 pares concordantes para DCC. En la Tabla 1 se resumen los datos clínicos relevantes de los pacientes y las respuestas a un cuestionario sobre el uso de antibióticos, antiinflamatorios no esteroideos en los 12 meses anteriores, gastroenteritis en los últimos 3 meses y hábitos dietéticos específicos que se han informado previamente. 22 Los sujetos nacieron entre 1936 y 1986 con grupos de pacientes, definidos por el estado de la enfermedad, siendo similares en edad (media ± DE) CCD 49,0 ± 18,5 (n = 8), sanos (HC) 52,8 ± 17,2 (n = 6), CIE 50,8 ± 4,5 (n = 6). De acuerdo con la escala de Harvey-Bradshaw23, todos los individuos estaban en remisión, a excepción de 2 (10b y 15a), que habían sido sometidos previamente a resección ileocecal. Sin embargo, ninguno de ellos tuvo recidiva postoperatoria, puntuación de recurrencia endoscópica <2,24 en la colonoscopia, lo que sugiere fuertemente que su puntuación de Harvey-Bradshaw reflejaba un trastorno funcional coexistente o posiblemente una malabsorción de ácidos biliares y una EC no activa. El uso de sujetos humanos para este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Condado de Örebro (Dnr167/03).
Tabla 1
Datos clínicos para pacientes
Recolección de biopsias
Los pacientes recibieron una limpieza intestinal estándar con la preparación de polietilenglicol, Laxabon (BioPhausia, Estocolmo, Suecia) la noche anterior a la colonoscopia. Se tomaron biopsias de íleon distal, colon ascendente, transverso y descendente, y recto, si era técnicamente posible. Se recolectaron dos biopsias de cada ubicación en cada sujeto utilizando pinzas de biopsia desechables (Olympus, Center Valley, PA). Las biopsias se colocaron inmediatamente en un tampón de congelación de 0,5 mL (5 mM K2HPO4, 1,3 mM KH2PO4, 2 mM Na3C6H5O7, 1 mM MgSO4x7H2O y 17,2% de glicerol) en tubos CryoPlus (Sarstedt, Alemania), se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -70 °C.
Extracción de ADN
Las biopsias se descongelaron en hielo y se centrifugaron a 15.000g durante 5 minutos. El tampón de congelación se eliminó por aspiración y se aisló el ADN de toda la biopsia utilizando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La extracción se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con la adición de 2 pasos de 45 segundos para batir las perlas en el nivel 5 en un FastPrep-24 (MP Biomedicals, Solon, OH) al comienzo del protocolo.
Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal (T-RFLP)
Para obtener un perfil de bacterias asociadas a la mucosa, el ADN total extraído de cada biopsia se analizó mediante T-RFLP utilizando un protocolo previamente desarrollado para el ADN extraído de las heces. 22 Brevemente, los genes bacterianos de ARNr 16S se amplificaron específicamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores bacterianos de amplio rango Bact-8F,25 5′-end marcados con 6-carboxifluoresceína y 926r26 (Tabla 2). Los productos de PCR resultantes se digierieron con HaeIII (New England BioLabs, Ipswich, MA) y se separaron en un secuenciador capilar ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los electroforegramas se procesaron utilizando Peak Scanner v1.0 (Applied Biosystems) y se calcularon las áreas de pico relativas de los fragmentos de restricción terminal (TRF) correspondientes a tamaños entre 50 y 500 pb dividiendo el área de pico individual por el área de pico total dentro de esta restricción de tamaño. Solo los picos por encima de un umbral del 0,5% se incluyeron en los análisis posteriores. Se estableció un umbral mínimo de 104 copias del gen ARNr 16S, medido mediante (q)PCR cuantitativa (véase más adelante), para evitar el sesgo debido a la baja abundancia total.
Cuadro 2
Oligonucleótidos para PCR, qPCR y polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP)
Clonación y secuenciación
Los genes de ARNr 16S se clonaron a partir de muestras de ADN seleccionadas (11a, 11b, 13a y 13b) para ayudar en la identificación de bacterias correspondientes a tamaños de TRF de interés basados en el análisis de datos de T-RFLP. Las muestras de ADN extraídas se amplificaron utilizando los cebadores Bact-8F y 926r.25,26 Los productos de PCR se purificaron en gel (Qiagen), se clonaron en el vector TOPO TA pCR 4.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en células químicamente competentes de E. coli TOP 10 (Invitrogen). Los transformantes se examinaron mediante amplificación por PCR con cebadores M13 (Invitrogen) y los tamaños apropiados de los productos de PCR se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa. A continuación, se analizaron los productos de PCR resultantes mediante T-RFLP como se ha descrito anteriormente y se secuenciaron los productos que dieron lugar a longitudes de TRF correspondientes a picos de interés. Las secuencias obtenidas se sometieron a asignación filogenética utilizando el RDP Naïve Bayesian rRNA Classifier v. 2.0. Las secuencias únicas se depositaron en GenBank en el NCBI con los números de acceso EU668957 a EU668961.
qPCR en tiempo real
Todos los ensayos de qPCR se realizaron en reacciones duplicadas de 25 μL en placas de 96 pocillos utilizando un sistema de detección en tiempo real iQ5 (BioRad, Hercules, CA). Se determinaron las copias totales del gen 16S rRNA para bacterias para cada muestra con los cebadores bacterianos generales (Tabla 2) utilizando iQ supermix (Biorad). El número de células humanas se determinó para las biopsias del íleon y el colon descendente utilizando cebadores de diseño propio específicos para el gen de la β-globina (Tabla 2), que se diseñaron utilizando MacVector 9.5.4 (Accelrys Software, San Diego CA). También se determinaron las copias del gen 16S rRNA para la bacteria específica Faecalibacterium prausnitzii utilizando cebadores específicos (Tabla 2). Escherichia coli se cuantificó utilizando cebadores de diseño propio que amplifican uidA (Tabla 2), codificando β-glucuronidasa, que es específica de E. coli y Shigella. La especificidad para E. coli se confirmó mediante PCR negativa para la ipaH específica de Shigella. Se realizaron 29 ensayos de qPCR para β-globina, uidA y F. prausnitzii utilizando SYBR GreenER qPCR Supermix para iCycler (Invitrogen). Las curvas de fusión resultantes se inspeccionaron visualmente para garantizar la especificidad de la detección del producto. Para la cuantificación del número de copias de ADN diana, se generaron curvas estándar para cada gen de interés utilizando productos de PCR extraídos en gel cuantificados con un fluorómetro Qubit (Invitrogen).
Análisis estadístico
Para evaluar la diversidad de la comunidad microbiana, definida por la uniformidad y la riqueza de los TRF, se aplicó el índice de diversidad30 de Simpson a los datos del T-RFLP. Se calcularon los índices de similitud dentro de los individuos, comparando cada ubicación con el consenso de todas las ubicaciones, utilizando métricas de Manhattan. 31 Las diferencias entre gemelos discordantes se calcularon utilizando métricas de Manhattan y la significación se comprobó mediante análisis de varianza (ANOVA; SPSS, Chicago, Illinois). Los datos de qPCR y los datos de abundancia para TRF individuales se analizaron como un ANOVA de 1 vía utilizando el modelo lineal general (SPSS). Las medias de los grupos se separaron por REGWF con significancia de P < 0,05. Los coeficientes de correlación se calcularon mediante el procedimiento de correlación de Pearson (SPSS).
Resultados
Perfiles de la comunidad asociados a la mucosa
De las 94 biopsias recogidas, 8 (3 CCD, 2 ICD, 3 HC) no se incluyeron en el análisis T-RFLP debido al bajo número de bacterias en esas muestras (<104 16S rRNA copias). Sin embargo, se incluyeron un mínimo de 3 biopsias de cada sujeto para su posterior análisis. Un total de 111 TRFs, representativos de diferentes ribotipos, fueron encontrados en los 20 individuos estudiados. El número promedio de TRF ± EE por biopsia fue de 28,2 ± 2,94, 27,4 ± 1,67 y 23,6 ± 5,99 para DCC, HC y DCI, respectivamente.
Densidad microbiana
El número de bacterias no se vio afectado por el fenotipo de la enfermedad (P = 0,376) ni por la localización de la muestra (P = 0,295). El número medio de copias del gen ARNr 16S por copia β-globina ± SE fue de 35,5 ± 15,6 y 25,2 ± 15,3 para CCD, 27,4 ± 15,7 y 11,4 ± 5,7 para HC, 17,0 ± 10,3 y 10,6 ± 5,3 para el DCI, para el íleon y el colon distal, respectivamente.
Diversidad
La diversidad microbiana (media ± EE), medida como una combinación de riqueza y uniformidad de TRF, fue menor (P < 0,004) en los individuos con DAI (0,798 ± 0,05) que en los que tenían CCD (0,850 ± 0,010) o HC (0,877 ± 0,018). Este resultado puede confundirse con la cirugía; sin embargo, la diversidad microbiana en los individuos con DCC que se habían sometido a cirugía no fue diferente (P = 0,67) de los individuos con DCC que no se habían sometido a cirugía.
Coherencia entre ubicaciones
El análisis de conglomerados de los perfiles T-RFLP, utilizando métricas de Bray Curtis, mostró que las composiciones microbianas en las muestras recogidas de un individuo se agruparon, independientemente de la ubicación de la biopsia (Fig. 1). Las puntuaciones de similitud para las biopsias, utilizando el índice de Manhattan, en comparación con la media de todas las biopsias dentro de un individuo fueron generalmente superiores al 80%, con un promedio del 88,5%. No se observaron diferencias en las estructuras de la comunidad microbiana en las diferentes ubicaciones muestreadas dentro de los individuos en los diferentes grupos muestreados (P = 0,25); con puntuaciones de similitud (media ± EE): grupos HC (86,0 ± 5,3), CIE (88,8 ± 3,3) y CCD (90,3 ± 1,7).
Figura 1
Árbol de similitud utilizando métricas de Bray Curtis de perfiles de fragmentos de restricción terminal del gen 16S rRNA bacteriano de biopsias recogidas del íleon (I), colon ascendente (A), colon transverso (T), colon descendente (D) y recto (R) de individuos con enfermedad de Crohn predominantemente ileal (barras magenta), enfermedad de Crohn predominantemente colónica (barras verdes) e individuos sanos (barras azules). El mismo número para los conjuntos de gemelos, seguido de una letra minúscula “a” o “b” para cada individuo de un par.
Similitud entre gemelos
Se compararon las estructuras comunitarias microbianas promedio de todas las ubicaciones de biopsia para cada individuo entre pares de gemelos emparejados. Los pares de gemelos discordantes, con DCI, tuvieron puntuaciones de similitud más bajas (36-53 %), medidas con datos de abundancia (índice de Manhattan), en comparación con los gemelos discordantes con DCC (52-66 %). Esto también se reflejó en similitudes promedio más bajas entre los pares de gemelos concordantes con DCI (48-62 %) en comparación con los gemelos concordantes con DCC (56 %-67 %). Estos datos muestran una tendencia (P < 0,07) de que los individuos con DCI sean menos similares a su gemelo que los individuos con DCC; sin embargo, los gemelos concordantes no fueron más similares (P = 0,29) que los gemelos discordantes.
Diferencias fenotípicas en la microbiota asociada a la mucosa
Faecalibacterium prausnitzii
El análisis de los datos de T-RFLP identificó que TRF223 era abundante en todos los individuos con HC y DCC, pero escaso o ausente en los sujetos con DCI. Este TRF correspondió a F. prausnitzii (98,2%-99,5% de similitud) según el cribado de secuencias de clones del gen 16S rRNA obtenidas de los mismos individuos. Cabe destacar que todas las secuencias fueron más similares a clones no cultivados depositados en bases de datos que a la cepa cultivada tipo F. prausnitzii.
Encontramos que F. prausnitzii, medido por qPCR como un porcentaje del total de genes de ARNr 16S (Fig. 2A) fue dramáticamente menor en individuos con DAI (P < 0,001) que en aquellos con CCD o HC, con valores respectivos de (media ± EE) 0,4 ± 0,89 (ICD), 11,3 ± 3,36 (CCD) y 8,7 ± 2,49 (HC). Gemelos discordantes (pares 16 y 18) segregados según el fenotipo de la enfermedad en lugar del par de gemelos para la abundancia de F. prausnitzii.
Figura 2
PCR cuantitativa en tiempo real para el gen 16S del ARNr de F. prausnitzii (A) y E. coli uidA (B) en el ADN de la mucosa del íleon, el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente y el recto (que se muestra de izquierda a derecha) de individuos con enfermedad de Crohn predominantemente colónica (DCC), controles sanos (HC) y con enfermedad de Crohn predominantemente ileal (DAI). El mismo número para los conjuntos de gemelos, seguido de una letra minúscula “a” o “b” para cada individuo de un par. *Individuos con DCC con alguna afectación ileal. **Individuos con DCI con alguna afectación colónica.
Escherichia coli
Diseñamos nuevos cebadores dirigidos al gen uidA para la cuantificación específica de E. coli mediante PCR en tiempo real (Fig. 2B). E. coli fue significativamente más abundante (P < 0,03) en las biopsias en todas las localizaciones de pacientes con DCI que en HC o aquellos con DCC. En 8 de 9 individuos enfermos positivos, ya sea CCD o ICD, cuando E. coli estaba presente en niveles detectables, se encontró en todas las localizaciones (1,3-4,5 log uidA por 106 genes de ARNr 16S). También se detectó E. coli en algunos individuos sanos (11b, 12a y 14a); sin embargo, solo en un máximo de 2 localizaciones y a un nivel de 1,2-2,5 log uidA por cada 106 genes de ARNr 16S. Sin embargo, en 1 par de gemelos concordantes con DCI (par 10) solo se detectó E. coli en 1 de los individuos, pero en todas las ubicaciones. Similar a la situación que observamos para F. prausnitzii, los gemelos discordantes con 1 individuo con EC localizada en el íleon segregados de acuerdo con el fenotipo de la enfermedad en lugar del par de gemelos con respecto a la abundancia de E. coli.
Discusión
Se sabe que el genotipo del huésped determina en parte la composición de la comunidad microbiana en el intestino humano. 15,–17 Por lo tanto, nuestra hipótesis era que mediante el estudio de la microbiota asociada a la mucosa de gemelos idénticos sería más fácil desentrañar las respectivas contribuciones de la genética del huésped y las bacterias intestinales a la etiología de la EC. Encontramos que los gemelos discordantes se segregaron de acuerdo con el fenotipo de su enfermedad en lugar de un par de gemelos con respecto a la abundancia de algunas poblaciones bacterianas específicas. Estos resultados sugieren que la composición bacteriana en el intestino está asociada con la enfermedad más que con el genotipo del huésped.
Utilizamos 2 enfoques moleculares para cuantificar la abundancia de poblaciones bacterianas específicas en las muestras de biopsia. Tanto el enfoque T-RFLP como el qPCR proporcionaron indicaciones significativas de que las especies bacterianas específicas eran más o menos abundantes en individuos con DCI en comparación con CCD o individuos sanos. En particular, el TRF223, correspondiente a F. prausnitzii, fue abundante en todos los individuos con HC y DCC, pero escaso o ausente en los sujetos con DCI. Previamente detectamos el mismo TRF en muestras fecales recolectadas de 21 de 22 individuos sanos, incluidos algunos de los mismos individuos incluidos en el presente estudio22 y en 89 de 90 niños sanos en un estudio separado,32 pero en ese momento no teníamos los datos de secuencia para hacer coincidir este TRF con una especie en particular. La presencia abundante y constante de F. prausnitzii en individuos sanos sugiere que es un miembro importante de la microbiota de la mucosa. F. prausnitzii produce butirato, formiato y D-lactato como producto de la fermentación,33 proporcionando la principal fuente de energía para las células epiteliales del colon y teniendo efectos sobre la integridad de la barrera epitelial y la modulación inmunitaria. 34,35 La actividad funcional de F. prausnitzii en la afectación de la fisiología del hospedero fue demostrada recientemente por Li et al,36 donde demostraron que su variación poblacional estaba asociada a 8 metabolitos urinarios de estructura diversa, incluyendo isoformas de butirato. La pérdida de F. prausnitzii y, por lo tanto, la reducción de la producción de butirato, puede desencadenar inflamación intestinal en individuos genéticamente susceptibles. La ausencia de este organismo también puede dejar un vacío que puede ser llenado por otros organismos, lo que resulta en una población menos estable.
Mediante qPCR, se confirmó que la abundancia de F. prausnitzii era significativamente menor en todas las biopsias recogidas de pacientes con DCI en comparación con los controles sanos y aquellos con localización de la enfermedad en el colon. Recientemente, se descubrió que Faecalibacteria y Subdoligranula representaban un total combinado del 0,4%, 15% y 26% de los clones de genes de ARNr 16S bacterianos de biopsias ileales en sujetos con DCI, controles sanos y CCD, respectivamente. 11 Martínez-Medina et al37 también observaron F. prausnitzii con mayor frecuencia en sujetos sanos (87%) en comparación con EC (53%); sin embargo, no separaron los fenotipos de CD en su análisis ni compararon los datos de abundancia. Vásquez et al20 detectaron F. prausnitzii por hibridación fluorescente in situ (FISH) en solo 5 de 22 pacientes con EC que habían sido sometidos a resección ileal, y a niveles bajos (1,8 ± 0,5%) en individuos positivos. Informes adicionales de reducción de abundancia y diversidad de Firmicutes,12,13 particularmente del grupo Clostridium leptum, del cual F. prausnitzii es miembro,38 coinciden con nuestros hallazgos; sin embargo, F. prausnitzii no se mencionó específicamente en esos estudios.
Swidsinski et al39 informaron recientemente que los niveles fecales bajos de F. prausnitzii, junto con los recuentos de leucocitos fecales, diferenciaron la EC activa de la CU. Aunque no indicaron la localización de la enfermedad en los pacientes con EC, encontraron que el tratamiento con altas dosis de cortisol o infliximab restauró los niveles de F. prausnitzii, lo que indica que esta bacteria está siendo suprimida por el sistema inmunitario del huésped. 39 Curiosamente, todos los gemelos inscritos estaban en remisión endoscópica, sin embargo, se observaron diferencias en F. prausnitzii en la CIE.
Otra población bacteriana que se diferenció según el fenotipo de la enfermedad fue E. coli. Previamente se ha reportado un aumento de la abundancia de E. coli en biopsias de pacientes con EC. 8,–10,12 Sin embargo, nuestro estudio y otros11 identifican un aumento particular en los niveles de E. coli en sujetos con DAI en comparación con HC. Encontramos una presencia consistente de E. coli en pacientes con EC, abarcando desde el íleon hasta el recto. Anteriormente, se encontró un aumento de la abundancia de E. coli en las biopsias de recto en pacientes con EC. 40 Aunque las E. coli no fueron aisladas ni tipificadas en este experimento, las E. coli aisladas de biopsias de EC en estudios previos 8,11 han mostrado un comportamiento similar al de los patógenos in vitro, incluida la supervivencia dentro de los macrófagos, y pueden desempeñar un papel en el proceso inflamatorio. 41 Se ha observado una reducción de la producción de α-defensinas y una reducción de la actividad antimicrobiana contra E. coli en el DCI, pero no en el CCD en comparación con la mucosa sana. 42 Este fenómeno explicaría directamente el aumento de la abundancia de E. coli en el DAI observado en este y otro estudio. 11 Curiosamente, el butirato induce la expresión de algunos péptidos antimicrobianos43; por lo tanto, una abundancia reducida de F. prausnitzii productora de butirato puede, en última instancia, resultar en una secreción reducida de péptidos y proteínas antimicrobianas que permiten la proliferación de E. coli.
No fue posible identificar ningún TRF que diferenciara claramente a los individuos con DCC de los HC, aunque hubo algunos TRF que fueron más comunes en el CCD que en el HC y el DCI. Sin embargo, un número cada vez mayor de informes han indicado diferencias entre los fenotipos de DCI y DCC, incluidos los efectos beneficiosos de la terapia antibiótica en la DCC, pero no en el DCI. 44,45 No se ha explicado la reducción de la efectividad de la terapia antibiótica en el DAI; sin embargo, puede ser el resultado de las diferencias en la composición microbiana en estos 2 fenotipos de la enfermedad y la localización intracelular de E. coli dentro de los macrófagos. 46 Cuando estudiamos previamente muestras fecales de estos sujetos, observamos que los perfiles comunitarios de gemelos con DCC eran similares a los de individuos sanos, mientras que los que tenían afectación ileal se separaban de los demás. 22
La consistencia de la composición bacteriana a lo largo del tracto intestinal en cada individuo, que va desde el íleon distal hasta el recto, sugiere que la disbiosis asociada con la EC no está localizada en el área de la enfermedad. Esta consistencia entre localizaciones, independientemente del fenotipo de la enfermedad, confirma los informes previos en individuos sanos y con EII. 19,37,47
La reducción de la diversidad bacteriana en los individuos con EC en comparación con sus gemelos sanos concuerda con muchos otros informes en poblaciones no gemelares,12,–14,48,49, pero este es el primer hallazgo que apunta específicamente a una menor diversidad para un fenotipo específico de la enfermedad (es decir, el DCI). Los informes sobre el aumento del número de bacterias asociadas con las biopsias de pacientes con EC en comparación con los controles sanos han sido inconsistentes. 47,50,51 No se observaron diferencias en el número de bacterias asociadas al fenotipo de la enfermedad; sin embargo, esto puede deberse a la naturaleza de los pacientes de control, ya que los individuos relacionados con los pacientes con EII también pueden tener alteraciones en las superficies mucosas aunque no sufran la enfermedad. 52,53
Reconocemos que estos resultados están sujetos a sesgos inherentes a la amplificación por PCR y que es posible que hayamos pasado por alto diferencias en algunos miembros de la comunidad microbiana; sin embargo, los sesgos fueron consistentes en todos los grupos. En esta investigación estudiamos pacientes que estaban en remisión y no enfermos, aunque la microbiota intestinal está alterada en un estado enfermo en comparación con un estado de reposo. 48 Los factores de confusión, como la cirugía y la medicación en el DAI, también pueden dar lugar a cierto escepticismo; sin embargo, cirugías similares se realizaron en individuos con DCC (12b y 13a), que tenían niveles normales de F. prausnitzii y ausencia de E. coli. Frank et al51 también encontraron que la apendicectomía no se correlacionó con la composición microbiana posterior en biopsias colónicas de pacientes con EII.
En conclusión, identificamos especies bacterianas específicas que aumentan o disminuyen significativamente en abundancia en individuos con EC en el íleon en comparación con individuos con EC en el colon y en individuos sanos. Específicamente, proponemos que cantidades más bajas de F. prausnitzii y cantidades más altas de E. coli son indicativas de EC ileal y pueden usarse para distinguir el fenotipo de la enfermedad ileal de la EC colónica y de los individuos sanos. Los datos de gemelos discordantes indican que el genotipo del huésped no es el único responsable de las diferencias observadas en la microbiota intestinal, sino que respaldan la hipótesis de que la DAI y la DCC son subgrupos diferentes de la enfermedad. Por lo tanto, proponemos que las abundancias relativas de F. prausnitzii y E. coli pueden servir como indicadores para distinguir el fenotipo de la EC y, eventualmente, pueden apoyar un tratamiento personalizado.
