El análisis independiente del cultivo de la mucosa ileal revela un aumento selectivo de Escherichia coli invasora de filogenia novedosa en relación con la depleción de Clostridiales en la enfermedad de Crohn que afecta al íleon

Martin Baumgart, Belgin Dogan, Mark Rishniw, Gil Weitzman, Brian Bosworth, Rhonda Yantiss, Renato H Orsi, Martin Wiedmann, Patrick McDonough, Sung Guk Kim, Douglas Berg, Ynte Schukken, Ellen Scherl, Kenneth W Simpson, Escherichia coli invasiva de nueva filogenia en relación con la depleción de Clostridiales en la enfermedad de Crohn que involucra el íleon, The ISME Journal, Volumen 1, Número 5, septiembre de 2007, páginas 403-418, https://doi.org/10.1038/ismej.2007.52

Abstracto

Las bacterias intestinales están cada vez más implicadas como un factor fundamental en el desarrollo de la enfermedad de Crohn, pero los componentes específicos del complejo entorno entérico polimicrobiano que impulsa la respuesta inflamatoria no están resueltos. Este estudio aborda el papel de la microflora asociada a la mucosa ileal en la enfermedad de Crohn. Se utilizó una combinación de análisis independiente del cultivo de la diversidad bacteriana (análisis de la biblioteca de ADNr 16S, PCR cuantitativa e hibridación fluorescente in situ) y caracterización molecular de bacterias cultivadas para examinar la flora asociada a la mucosa ileal de pacientes con enfermedad de Crohn que afecta al íleon (13), enfermedad de Crohn restringida al colon (CCD) (8) e individuos sanos (7). El análisis de las bibliotecas de ADNr 16S construidas a partir de la mucosa ileal arrojó nueve clados que se segregaron según su origen (P<0,0001). Las bibliotecas de ADNr 16S de la mucosa de ileítis se enriquecieron en secuencias de Escherichia coli (P<0,001), pero se agotaron relativamente en un subconjunto de Clostridiales (P<0,05). La PCR del ADN de la mucosa fue negativa para Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, Shigella y Listeria. El número de E. coli in situ se correlacionó con la severidad de la enfermedad ileal (ρ 0,621, P<0,001) y la E. coli invasiva se restringió a la mucosa inflamada. Las cepas de E. coli aisladas del íleon fueron predominantemente novedosas en filogenia, mostraron un comportamiento similar al de patógenos in vitro y albergaron elementos cromosómicos y episomales similares a los descritos en E. coli patógena extraintestinal y Enterobacteriaceae patógena. Estos datos establecen que la disbiosis de la flora asociada a la mucosa ileal se correlaciona con un fenotipo de enfermedad de Crohn ileal (DAI), y plantean la posibilidad de que un aumento selectivo de un nuevo grupo de E. coli invasora esté implicado en la etiopatogenia de la enfermedad de Crohn que afecta al íleon.

Introducción

La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) crónica debilitante que prevalece en Europa y América del Norte (Loftus, 2004; Hanauer, 2006). Se considera ampliamente como una consecuencia de la inflamación intestinal descontrolada en respuesta a una combinación de factores ambientales, microbianos entéricos e inmunorreguladores elusivos en individuos genéticamente susceptibles (Hanauer, 2006; Sartor, 2006). La susceptibilidad genética está cada vez más ligada a defectos en la inmunidad innata ejemplificados por mutaciones en el receptor inmune innato NOD2/CARD15, que en presencia de la microflora entérica pueden conducir a una producción de citoquinas mucosa regulada, retraso en la eliminación bacteriana y aumento de la translocación bacteriana, promoviendo y perpetuando así la inflamación intestinal (Ahmad et al., 2002; Hanauer, 2006; Sartor, 2006; Wehkamp y Stange, 2006). Esta posibilidad está respaldada por estudios que han demostrado el papel fundamental de la microflora entérica en el desarrollo de la EII en animales con susceptibilidad modificada (Elson et al., 2005; Kim et al., 2005). Sin embargo, la relación de la flora entérica con la inflamación de la mucosa en pacientes con enfermedad de Crohn está lejos de estar clara, con bacterias patógenas como Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, Listeria, Streptococcus y Escherichia coli, (Liu et al., 1995; Shanahan y O’Mahony, 2005; Sartor, 2006; Barnich y Darfeuille-Michaud, 2007), o desequilibrios en la proporción de bacterias beneficiosas y dañinas denominadas “disbiosis”, implicadas en el desarrollo de la inflamación (Tamboli et al., 2004; Seksik et al., 2005).

Los avances en microbiología molecular han llevado a una nueva conciencia de la diversidad y complejidad de la flora entérica. Solo el 30% de la flora fecal se considera cultivable, y existe una variación significativa en la flora en diferentes segmentos gastrointestinales y contenidos luminales frente a la mucosa en individuos sanos (Hayashi et al., 2002; Eckburg et al., 2005; Lepage et al., 2005). La aplicación de sondas de oligonucleótidos marcadas dirigidas a los principales subgrupos de bacterias entéricas a las biopsias intestinales de pacientes con enfermedad de Crohn ha facilitado el examen independiente del cultivo de la distribución espacial de la flora mucosa que se considera que interactúa más estrechamente con el sistema inmunitario innato (Kleessen et al., 2002; Swidsinski et al., 2002; Mylonaki et al., 2005; Swidsinski et al., 2005). Sin embargo, los resultados han sido inconsistentes, ya que algunos investigadores informaron de invasión de la mucosa (Kleessen et al., 2002; Mylonaki et al., 2005) aumento de la colonización por Enterobacteriaceae (Mylonaki et al., 2005) o la subdivisión Gamma de Proteobacterias, Enterobacteriaceae y Bacteroides/Prevotella (Kleessen et al., 2002), mientras que otros describen la presencia de una biopelícula no invasiva de Bacteroides (Swidsinski et al., 2005). Esta discordancia entre los estudios puede deberse a diferencias en las poblaciones de pacientes y la metodología (por ejemplo, los sitios de biopsia y la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH)), pero también podría reflejar una falta de consideración de la enfermedad de Crohn como un grupo de trastornos estrechamente relacionados pero distintos, en lugar de una sola enfermedad (Hanauer, 2006; Sartor, 2006). La distribución de la inflamación intestinal en pacientes con enfermedad de Crohn es variable, con enfermedad restringida al íleon (aproximadamente 33%) o colon (aproximadamente 20%), o involucrando tanto el íleon como el colon (aproximadamente 40%) (Ahmad et al., 2002). Las diferencias en la susceptibilidad genética (Ahmad et al., 2002) y las respuestas inmunes adaptativas a la microflora entérica (Arnott et al., 2004; Targan et al., 2005) de los pacientes con enfermedad de Crohn que afecta al íleon, en comparación con aquellos con DCC, sugieren que la composición y la distribución espacial de la flora mucosa también pueden variar según el fenotipo de la enfermedad. Esta noción se apoya en la mayor prevalencia de E adherente e invasiva. cepas de coli (AIEC) cultivadas a partir de la mucosa ileal de pacientes con ileítis de Crohn, en comparación con aquellos con DCC (Darfeuille-Michaud et al., 2004; Barnich y Darfeuille-Michaud, 2007), pero no ha sido corroborada por metodologías contemporáneas independientes de la cultura.

Abordamos esta cuestión combinando el análisis imparcial independiente del cultivo de la diversidad bacteriana con la localización in situ y la caracterización basada en el cultivo de la flora asociada a la mucosa ileal de pacientes con enfermedad de Crohn que afecta al íleon, pacientes con DCC e individuos sanos. Mostramos que la mucosa ileal de los pacientes con enfermedad de Crohn que afecta al íleon con frecuencia alberga un mayor número de E. coli y relativamente menos clostridiales, que los pacientes con DCC y los individuos sanos. Demostramos que el número de E. coli visualizado en las biopsias ileales está relacionado con la gravedad de la ileítis, y descubrimos que las cepas invasoras de E. coli aisladas del íleon son predominantemente novedosas en filogenia y albergan elementos cromosómicos y episomales que son homólogos a los descritos en E. coli uropatógena y patógena aviar. y Enterobacteriaceae patógenas. Estos datos establecen que la disbiosis de la flora asociada a la mucosa ileal se correlaciona con un fenotipo de enfermedad de Crohn ileal (DAI), y plantean la posibilidad de que un aumento selectivo de un nuevo grupo de E. coli invasora esté implicado en la etiopatogenia de la enfermedad de Crohn que afecta al íleon. Sugieren que un enfoque integrado que tenga en cuenta la flora asociada a la mucosa de un individuo, además del fenotipo y el genotipo de la enfermedad, puede mejorar el resultado.

Materiales y métodos

Pacientes y características clínicas

Se estudiaron 28 pacientes: 13 con enfermedad de Crohn que afectaba al íleon (DAI, cinco con enfermedad restringida al íleon y ocho con afectación ileocolónica), ocho con DCC e íleon normal (DCC) y siete pacientes sanos sometidos a colonoscopia de vigilancia (sanos) (Tabla suplementaria 1). El íleon terminal fue intubado como parte del estándar de atención en todos los pacientes. Tras la visualización directa de la mucosa ileal, se registró una puntuación de gravedad basada en el Índice de Gravedad Endoscópica de la Enfermedad de Crohn y la Puntuación Endoscópica Simple para la Enfermedad de Crohn (Mary y Modigliani, 1989; Daperno et al., 2004). La gravedad se reportó de la siguiente manera: grado 1 = sin inflamación; grado 2=hiperemia; grado 3 = ulceraciones ápticas; Grado 4 = úlceras grandes y grado 5 = úlceras muy grandes y profundas. Para garantizar la consistencia, todos los procedimientos endoscópicos fueron realizados por el mismo endoscopista (E. Scherl) y las puntuaciones se registraron de forma prospectiva. Las biopsias ileales se tomaron con pinzas endoscópicas estériles estándar de un solo uso. Este estudio fue aprobado por el Comité de Sujetos Humanos de la Universidad de Cornell (Protocolo 05-05008). Todos los pacientes firmaron su consentimiento informado para participar y proporcionar biopsias de mucosa al Banco de Tejidos (Protocolo 0603-859). Los grupos de pacientes fueron similares en edad (media± d.s.: CIE 45,3±18, CCD 52,6±18 y sanos 54,9±11,78) y duración de la enfermedad (11,3±11,4 años CIE y 13,1±15,7 años DCI). Los pacientes con DCI tuvieron una enfermedad más grave que la DCC: 5/13 requirieron cirugía, 4/13 fístulas, en comparación con 1/8 de cirugía y 1/8 de fístula. La proporción de pacientes que recibieron gluocorticoides, ácido aminosalicílico (AAS), inmunomoduladores, biológicos y antimicrobianos no fue significativamente diferente en el DAI y el DCC.

Las biopsias de la mucosa ileal fueron evaluadas histológicamente para determinar la presencia y el alcance de la inflamación por un patólogo gastrointestinal ciego a los otros resultados (Odze et al., 1993). La gravedad de la inflamación neutrofílica se clasificó de la siguiente manera: 0 = sin inflamación; 1=criptitis neutrofílica, limitada al <50% de la muestra; 2 = criptitis con abscesos de criptas luminales presentes en el <50% de la muestra y 3 = inflamación neutrofílica difusa (>50% de la muestra) en múltiples criptas con ulceración. También se registró la presencia o ausencia de características de lesión crónica, como distorsión de la arquitectura de las criptas, metaplasia pseudopilórica y/o granulomas.

Bibliotecas de ADNr 16S

Se establecieron bibliotecas individuales de genes de ADNr 16S para un subconjunto de 20 biopsias ileales que se seleccionaron al azar de cada grupo inscrito en el estudio: Sano (6), CIE (7) y CCD (7). Las biopsias ileales ultracongeladas recogidas en recipientes estériles libres de ADN y almacenadas a -70 °C en el Banco de Tejidos Weill-Cornell se recibieron congeladas en crioviales codificados numéricamente y se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento. Las biopsias se transfirieron asépticamente de los crioviales a un triturador de tejidos desechable junto con 0,25 ml de solución salina fisiológica estéril. La mitad del homogeneizado de tejido se evaluó mediante cultivo bacteriano (descrito a continuación) y el resto se utilizó para la construcción de la biblioteca 16S. Se extrajo ADN de homogeneizados de mucosas y se amplificó un fragmento de 320 pb de ADNr bacteriano 16S mediante PCR, se purificó en columna y se clonó en un vector de clonación de TA (pGEM-T Easy, Promega, Madison, WI, EE. UU.), como se describió anteriormente (Simpson et al., 2006). Para eliminar el ADN potencialmente contaminante, se filtró agua destilada estéril de PCR a través de filtros Micron YM-100 (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.) y se expuso a irradiación UV durante 10 min.

Los clones candidatos se examinaron mediante digestión de restricción, y los clones que contenían fragmentos del tamaño correcto se secuenciaron en el Centro de Recursos Biológicos de la Universidad de Cornell, utilizando cebadores M13 y un secuenciador de ADN automatizado ABI 3700 y kits de secuenciación ABI PRISM-BigDye™ Terminator con ADN polimerasa AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Las secuencias de ADN obtenidas con cebadores directos e inversos se limpiaron de secuencias de vectores contaminantes en Sequencher (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, EE. UU.), se corrigieron contra el rastro de secuencia y se alinearon con Meg-Align (DNAStar Inc., Madison, WI, EE. UU.). Las secuencias se enviaron al GENBANK (EF205650-EF206282).

Identificación de secuencias de ADNr 16S asociadas a diferentes poblaciones fuente

Se introdujo en SourceCluster una matriz de distancias, generada por múltiples alineamientos de secuencias de ADNr 16S para cada aislado mediante análisis filogenético mediante parsimonia (PAUP), para determinar si los aislados del mismo grupo (ICD, CCD, Healthy) se agrupaban por secuencia (Nightingale et al., 2006). Con el fin de encontrar ramas específicas en el árbol filogenético, en las que los aislados de un grupo específico son más abundantes o escasos de lo esperado por casualidad, utilizamos TreeStats. Específicamente, TreeStats evalúa si, para cada clado en el árbol filogenético, el número observado de secuencias pertenecientes a cada grupo es significativamente diferente del número esperado bajo la hipótesis nula de no agrupamiento entre aislados del mismo grupo. Se utilizó una prueba de bondad de ajuste χ² para comparar los números observados con los números esperados en 10 000 permutaciones del etiquetado para cada clado (Nightingale et al., 2006). El nivel más alto de significación asignado por Treestats es P = 0,0001, lo que permite la corrección de Bonferroni (P = 0,05 / número de comparaciones) para 500 comparaciones múltiples. Para evaluar aún más la reproducibilidad del análisis y probar el poder de resolución del análisis 16S, construimos un árbol de unión de vecinos de arranque (1000 réplicas de arranque). La identidad de las secuencias parciales de ADNr 16S se determinó mediante comparación con las bases de datos de secuencias del proyecto Ribosomal Database (RDPII: http://rdp.cme.msu.edu/) y NCBI (BLAST-n).

Cuantificación de E. coli con PCR en tiempo real

Los cebadores (uidA-F_5′-TGTGATATCTACCCGCTTCGC-3′, uidA-R_5′-CAGGAACTGTTCGCCCTTCA-3′) y una sonda (5′-/56-FAM/TCGGCATCCGGTCAGTGGCA/3BHQ-1/-3) para E. coli uidA fueron diseñados por ellos mismos en el programa Primer Express 1.0 para Macintosh OS9 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las reacciones se realizaron utilizando Amplitaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) en un formato de 96 pocillos con un volumen de reacción de30 μ l por pocillo, y para cada muestra de ADN estándar, sin patrón de control o mucosa en tripletes. Las condiciones de reacción de los cebadores y las sondas fueron las siguientes: 50 °C durante 2 min, 94 °C durante 10 min, seguidos de 40 ciclos a 94 °C durante 20 s, 55 °C durante 20 s y 72 °C durante 30 s. Se generó una curva estándar a partir de ADN aislado de E. coli de concentración conocida determinada por siembra cuantitativa. La fluorescencia se midió en cada paso de 72 °C. Para permitir la normalización del tamaño de la biopsia, cuantificamos el ARNr 18S humano utilizando el kit de control RT-CKFT-18S (Eurogentec, Seraing, Bélgica), y los valores del ARNr 18S se convirtieron en número de células, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ciclo de PCR se realizó en un sistema de detección de secuencia de prisma ABI 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Los datos se analizaron con el software de detección de secuencias 1.2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y el número de E. coli se expresó como unidad formadora de colonias (UFC)/millón de células humanas.

PCR para mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), Listeria y Shigella

La presencia de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), Listeria y Shigella en ADN extraído de biopsias ileales terminales se examinó mediante PCR con cebadores dirigidos contra IS900, hlyA e ipaH (Norton et al., 2001; Kim et al., 2002; Martin et al., 2004).

PESCADO

Las secciones histológicas fijadas en formol e incluidas en parafina de biopsias de íleon terminal de ICD (12), CCD (7) e individuos sanos (8) se montaron en portaobjetos Probe-On Plus (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.) y se evaluaron mediante FISH con sondas a todas las bacterias (EUB338), un subconjunto de Enterobacteriaceae (1531, 23SrRNA: E. coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella) y E. coli/Shigella (E. coli, 16SrRNA), como se ha descrito anteriormente (Poulsen et al., 1994; Jansen et al., 2000; Simpson et al., 2006). La evaluación inicial se realizó con una combinación de EUB-338 (Cy3-5′) y una sonda de control no vinculante (no EUB338: FAM-5′), con hibridaciones posteriores empleando EUB338-5′FAM en combinación con 1531-Cy3-5′) o E. coli Cy3-5′ (IDT, Coralville, IA, EE. UU.). Se utilizaron portaobjetos manchados con suspensiones de bacterias cultivadas para controlar la especificidad de la sonda (Simpson et al., 2006). Las secciones se examinaron con un microscopio de epifluorescencia Olympus BX51. Las imágenes se capturaron con una cámara DP-70 y un software DP-Controller con archivos de imagen procesados con DP-Manager (Olympus America, Center Valley, PA, EE. UU.). Se obtuvieron recuentos bacterianos totales para 10 campos elegidos al azar (60 × ) para cada sección, promediados y expresados como bacterias/mm².

Cultivo de bacterias asociadas a la mucosa ileal

Las biopsias ileales congeladas de DAI (13), CCD (8) y controles sanos (7) se molieron como se describió anteriormente, y la mitad del homogeneizado de tejido se utilizó para inocular agar tripticasa de soja con 5% de sangre de oveja, colistina Columbia y agar ácido nalidíxico (CNA) y caldo gramnegativo (GN). Todos los medios se incubaron a 37 °C durante 18-24 h en CO₂ al 6 %, momento en el que se analizaron en busca de bacterias objetivo, y el caldo GN se subcultivó en agar azul de metileno (EMB) de eosina Levine, agar MacConkey con 4-metilumbeliferol-β-D-glucurónido (MUG), agar verde brillante con novobiocina y agar xilosa-lactosa-tergitol 4, e incubado a 37 °C durante 18-24 h. antes de comprobar si hay colonias; el agar XLT-4 se incubó durante 18-24 h adicionales si no se observaban colonias típicas. El tejido molido también se inoculó en agar Campylobacter con cinco antimicrobianos y un 10% de sangre de oveja, que se incubó en una cámara microaerófila a 42 °C durante 48 h antes de la selección de especies de Campylobacter. El cultivo anaeróbico se realizó mediante siembra en agar lecitina-lactosa en una cámara anaeróbica e incubación durante 18-24 h a 37 °C, antes de seleccionar las colonias. Las bacterias aeróbicas se examinaron mediante tinción de Gram, reacción de catalasa y oxidasa, y luego se identificaron utilizando el sistema Sensititre automático controlado desde computador (TREK Diagnostic Systems, Cleveland, OH, EE. UU.). Se utilizaron reacciones bioquímicas convencionales utilizando estrategias de identificación estándar según fue necesario para complementar el sistema de identificación Sensititre. Las bacterias anaerobias se identificaron mediante el método del disco de Wadsworth. Los aislados se archivaron a -80 °C y las bacterias frescas no transitadas se utilizaron para investigaciones posteriores según fuera necesario.

Caracterización molecular de E. coli

Sobre la base del análisis de la secuencia de ADNr 16S, se examinaron entre 10 y 15 colonias individuales de E. coli de cada biopsia mediante DNA-PCR POLIMÓRFICO AMPLIFICADO AL AZAR (RAPD-PCR), y se seleccionaron aislados representativos que diferían en el genotipo general para los análisis posteriores. Los aislados bacterianos se almacenaron a -80 °C y se utilizaron bacterias frescas no transitadas para todas las investigaciones. Los aislados de E. coli se estrearon en agar Luria-Bertani (LB) y una sola colonia se inoculó en caldo LB. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C sin agitar.

La diversidad genética de los aislados de E. coli se evaluó mediante RAPD-PCR con cebadores informativos 1254 y 1283 (Simpson et al., 2006). Los principales grupos filogenéticos de E. coli (A, B1, B2 y D) (2, 3) se determinaron mediante PCR triplex (Clermont et al., 2000). Los aislados de E. coli se serotipificaron para detectar antígenos OH y se examinaron mediante PCR para detectar la presencia de genes que codifican las fimbrias K99, F1845 y CS31A; toxina termolábil (LT); toxinas termoestables, STa y STb; Toxinas similares a Shiga tipos I y II, SLTI y SLTII; factores necrosantes citotóxicos 1 y 2 (CNF1 y CNF2); e intimina-γ (eae), en el Centro de Referencia de E. coli de la Universidad Estatal de Pensilvania (DebRoy y Maddox, 2001). La presencia de ibeA, papC, afaB-afaC, sfaD-sfaE y focG se determinó mediante PCR (Martin et al., 2004; Moulin-Schouleur et al., 2006).

La tipificación de secuencias multilocus (MLST) para siete loci (aspC, clpX, fadD, icdA, lysP, mdh, uidA) se realizó de acuerdo con el protocolo establecido por Whittam y colaboradores (http://www.shigatox.net/stec/mlst-new/mlst_pcr.html). Los amplicones de PCR purificados en columna se secuenciaron en el Centro de Recursos Biológicos de la Universidad de Cornell, utilizando cebadores de PCR directa e inversa y un secuenciador de ADN automatizado ABI 3700 y kits de secuenciación ABI PRISM BigDye Terminator con ADN polimerasa AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Las secuencias de ADN obtenidas con cebadores directos e inversos se revisaron y luego se ensamblaron en SeqMan (DNAStar, Madison, WI, EE. UU.). Las secuencias se alinearon mediante el algoritmo Clustal-W en MegAlign (DNAStar, Madison WI, EE.UU.), y se determinaron el alelo, st7 y el grupo clonal mediante el software basado en la web (http://www.shigatox.net/stec/mlst-new/mlst_pcr.html).

Líneas celulares y condiciones de cultivo

Las células Caco-2 (ATCC HTB-37) se cultivaron en un medio esencial mínimo (Gibco, Rockville, MD, EE. UU.) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 15%, piruvato de sodio 1 mM y solución de aminoácidos no esenciales (NEAA) a 0,1 mM. Las células HEp-2 (ATCC CCL-23) (derivadas de un carcinoma de laringe humano) y la línea celular murino similar a los macrófagos J774-A1 se cultivaron en Rosewell Park Memorial Institue 1640 (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY, EE. UU.) suplementadas con un 10% de FBS. Las monocapas de todas las líneas celulares se mantuvieron a 37°C en aire al 5%CO₂:95% (vol/vol). La concentración de FBS se redujo al 5% antes de los ensayos de infección.

Invasión de células epiteliales intestinales cultivadas

Las capacidades invasivas de los aislados de E. coli se evaluaron en células epiteliales cultivadas mediante el ensayo de protección con gentamicina. Las células de Caco-2 se cultivaron en placas de 24 pocillos durante 7 días (∼5 × 10,⁶) y se infectaron con cepas de E. coli a una multiplicidad de infección (MOI) de 20 durante 3 h. Las bacterias intracelulares se determinaron como se describió anteriormente (Simpson et al., 2006). Cada ensayo se realizó por duplicado y se repitió al menos tres veces. La invasión se expresó como el número total de UFC/ml recuperados por pocillo. Se utilizaron como controles negativos y positivos una cepa no invasiva de E. coli (DH5α) y una cepa de E. coli LF82, una cepa aislada de un paciente con DAI en Francia que muestra un comportamiento adherente e invasivo en células cultivadas.

La participación del citoesqueleto de la célula huésped en el proceso de invasión se examinó utilizando el inhibidor de microfilamentos citocalasina D y el inhibidor de microtúbulos colchicinas, como se describió anteriormente (Simpson et al., 2006), con algunas modificaciones. Las células HEp-2 se cultivaron hasta la confluencia en placas de 24 pocillos durante 2 días. Se añadió citocalasina D (0,5 μg/ml) o 1 μg/ml de colchicina a las células HEp-2 30 min antes de la adición de bacterias. Las células se infectaron a un MOI de 20 durante 3 h. Después del período de infección, las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se incubaron durante otra 1 h en un medio que contenía gentamicina (100 μg/ml) para matar las bacterias extracelulares. El número de bacterias intracelulares se determinó mediante diluciones seriadas en siembra, como se describió anteriormente. La invasión en presencia de cada inhibidor se normalizó al control sin inhibidor para cada cepa, y se informó como un porcentaje del nivel de invasión de control (100%).

Persistencia y replicación dentro de células epiteliales y macrófagos

Para determinar si E. coli podía sobrevivir o multiplicarse dentro de las células Caco-2, el ensayo de invasión estándar se modificó mediante una incubación adicional de monocapas infectadas durante un máximo de 24 h. Después de la invasión e incubación con gentamicina (100 μg/ml), las células se lavaron una vez en PBS y se añadió a las células un medio fresco que contenía 15 μg/ml de gentamicina. A las 1 y 24 h post-gentamicina, se determinó el número de bacterias intracelulares como se describió anteriormente. La supervivencia se expresó como el porcentaje de bacterias presentes dentro de las células a las 24 h en comparación con el número internalizado a 1 h (100%).

La supervivencia intracelular y la replicación en macrófagos J774 se determinó como se describió anteriormente (Glasser et al., 2001), con algunas modificaciones. Las monocapas J774 se infectaron con un MOI de 20 bacterias por macrófago. Después de una incubación de 2 h a 37 °C con 5% de CO₂, los macrófagos infectados se lavaron dos veces con PBS y se agregó un medio de cultivo celular fresco que contenía gentamicina (100 μg/ml) para matar las bacterias extracelulares. Después de la incubación durante 1 h más, se retiró el medio y se añadió un medio fresco que contenía gentamicina (20 μg/ml) durante períodos más largos después de la infección. Las células se lavaron una vez con PBS y se añadió 1 ml de Triton X-100 al 1% (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, EE.UU.) en agua desionizada a cada pocillo durante 5 min, para lisar las células eucariotas. Esta concentración de Triton X-100 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad bacteriana durante al menos 30 min. Las muestras se retiraron, se diluyeron y se colocaron en placas de agar LB para determinar el número de UFC recuperadas de las monocapas lisadas. El número de bacterias que sobrevivieron al ensayo de eliminación de gentamicina se determinó a las 1 y 24 h después del tratamiento con gentamicina. La supervivencia se expresó como el porcentaje medio del número de bacterias recuperadas después de 1 h después de la infección, definido como 100%.

Sustracción del genoma y separación y secuenciación de plásmidos

Las cepas de E. coli 541-1, 541-15, LF82 y K-12 (MG1655) se cultivaron en medio caldo de 30 ml LB sin antibiótico a 37^oC durante la noche. El ADN genómico de alta calidad, extraído utilizando un kit comercial (Qiagen Genomic-tip 500, Qiagen Inc, Valencia CA, EE.UU.), se sometió a hibridación supresora sustractiva (Akopyants et al., 1998) utilizando un kit comercial (Clontech PCR-select Bacterial Genome Subtraction kit, Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.), con E. coli MG1655 como cepa conductora, con las siguientes modificaciones al protocolo. Brevemente, 10 μ gde ADN de cada cepa se digierieron con Rsa1 y se purificaron en columna con columnas de purificación de ADN (kit de eliminación de nucleótidos QIAQuick, Qiagen Inc, Valencia CA, EE. UU.) para obtener 2 μg de ADN para hibridación. Los productos de PCR anidados se clonaron en un vector de clonación de TA (pGEM-T-Easy, Promega, Madison, WI, USA) y se secuenciaron 40 clones. Las secuencias se examinaron con BLASTn y BLASTX (NCBI, Bethesda MD, EE. UU.) para comprobar su homología con genes bacterianos conocidos. Las secuencias se enviaron al GENBANK (EI011446-EI011511).

Los plásmidos se extrajeron y purificaron de las cepas de E. coli 541-15 y LF82 utilizando kits de purificación comerciales. Los plásmidos se digierieron aleatoriamente con Tsp5091 y los fragmentos se clonaron y secuenciaron como se describió anteriormente. Las secuencias se enviaron al GENBANK (EI100642-EI100659).

Para determinar si las secuencias de nucleótidos con homología a pMT1, ColV, ratA y hcp contenidas en las bibliotecas sustractivas de E. coli LF82 y 541-15 estaban asociadas con el DCI, o con un patotipo adherente e invasivo en células cultivadas, examinamos nuestra colección de 22 cepas mediante PCR (Tabla suplementaria 2).

Análisis estadístico

El análisis estadístico de las diferencias en el origen de las secuencias 16S se describe anteriormente. Las diferencias en la frecuencia de secuencias 16S en una biblioteca, el número de E. coli ileal (determinado por PCR cuantitativa y FISH) en Healthy, CCD y ICD, el patotipo in vitro de diferentes filogrupos (A, B1, B2, D) y la frecuencia de genes de virulencia en diferentes patotipos se evaluaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, con la prueba de Mann-Whitney como post-test. Los análisis de correlación entre FISH y PCR, y FISH y PCR versus actividad de la enfermedad, se realizaron con la prueba de correlación de rangos de Spearman. Las diferencias en el patotipo in vitro y la frecuencia de genes de virulencia en cepas de E. coli aisladas de íleon normal (sanos+CCD) y DAI se evaluaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Las diferencias en la duración de los signos clínicos y el tratamiento de la DAI y la DCC se evaluaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Un valor de P<0.05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Las bibliotecas de ADNr 16S de la ileítis de Crohn se enriquecen selectivamente en secuencias de E. coli y se agotan en un subconjunto de Clostridiales

Para crear un inventario de la flora dominante asociada a la mucosa ileal, secuenciamos 616 clones de ADNr 16S amplificados a partir de ADN ileal de siete pacientes con DAI (217 clones), seis con DCC con íleon normal (177 clones) y siete individuos sanos (222 clones), a un promedio de 31 clones por biopsia. El análisis de secuencias, utilizando un enfoque estadístico diseñado para identificar secuencias asociadas con diferentes poblaciones de origen, identificó nueve clados que se asociaron significativamente con una fuente definida (P<0.0001) (Figura 1). Se encontraron diferencias en la prevalencia de secuencias en bibliotecas de clones individuales de diferentes poblaciones de origen (Healthy, ICD, CCD) para tres clados (Figura 1). En la Figura 1 se presenta una versión totalmente anotada de este análisis.

Figura 1

Análisis de secuencias de ADNr 16S de mucosa ileal según origen. Se evaluaron las secuencias de ADNr 16S de Healthy, ICD y CCD según su origen. Los nodos marcados con un óvalo en negrita indican diferencias significativas según el origen (P<0,0001). La prevalencia de secuencias en una biblioteca de clones de pacientes individuales para cada clado se muestra en los gráficos de barras del lado derecho. Tres clados contienen secuencias que son significativamente diferentes en prevalencia: las secuencias en el clado 1 (que mostró un soporte de arranque del 100% en un árbol NJ con 1000 réplicas de arranque) son más prevalentes en ICD (26,4%) en comparación con el íleon normal de CCD (0,5%, P = 0,0012) o Sano (1,4%, P = 0,0006), y son exclusivamente Enterobacteriaceae, coincidiendo con E. coli y Shigella en la base de datos del NCBI. Las secuencias en el clado 2 (en este clado la rama soportada por el último nodo con un valor P significativo es soportada por un valor de bootstrap del 95%) son menos prevalentes en las bibliotecas de mucosa de DCI (3,1% de las de una biblioteca de clones), en comparación con las saludables (15,5%, p=0,0175). Las secuencias de este clado son predominantemente Lachnospiraceae, (Ruminococos, Roseburia y Coprococci). Las secuencias en el clado 3 (soporte bootstrap del 92%) son menos prevalentes en el ICD (0,4%) en comparación con Healthy (15%, P = 0,038) y CCD (26%, P = 0,0012). Las secuencias de este grupo son predominantemente Clostridiales pertenecientes a los géneros Faecalibacteria y Subdoligranula. Los valores de arranque del árbol NJ (si >50) se muestran para las ramas seleccionadas. CCD, enfermedad de Crohn restringida al colon; DCI: enfermedad de Crohn ileal.

Las secuencias del primer clado fueron más prevalentes en el CIE (26,4%) que en el íleon del CCD (0,5%, P=0,0012) y Sano (1,4%, P=0,0006), y fueron exclusivamente Enterobacteriaceae, coincidiendo con E. coli y Shigella en la base de datos del NCBI. La PCR para detectar Shigella (ipaH) en el ADN ileal fue negativa, lo que indica que estas secuencias se originaron a partir de E. coli. Para abordar la posibilidad de sesgo de biblioteca y determinar si el aumento de la prevalencia de secuencias de E. coli en el DAI era relativo o absoluto, evaluamos los extractos de ADN de la mucosa utilizados para la construcción de la biblioteca de 16srDNA mediante PCR cuantitativa para E. coli (uidA, normalizado a ADNr mucoso18S). Los resultados (Figura 2) validaron nuestro análisis de la biblioteca 16S y proporcionaron una clara indicación de que E. coli era significativamente más numerosa en el íleon de los pacientes con DAI (mediana 55 352/10⁶ células mucosas) que CCD (mediana 10 674/10⁶ células mucosas, p = 0,035) y sanas (mediana 410/10⁶ células mucosas, p = 0,0175).

Figura 2

PCR cuantitativa para E. coli uidA en ADN de la mucosa del íleon de individuos sanos, CCD e ileítis de Crohn (DAI). Los resultados de la PCR cuantitativa para uidA se normalizaron a ADNr 18S en extractos de mucosa y se expresaron como copias de uidA/millón de células. CCD, enfermedad de Crohn restringida al colon; DCI: enfermedad de Crohn ileal.

En contraste con el aumento de la prevalencia de secuencias asociadas a la CIE en el clado 1, el segundo y tercer clados contenían secuencias que eran menos prevalentes en la CIE. En el clado 2, que contenía predominantemente Lachnospiraceae, las secuencias de la mucosa de ICD representaron solo el 3,1% de las de una biblioteca de clones, en comparación con el 15,5% en Healthy (p = 0,0175) y el 7,9% en CCD (p = 0,2949). En el tercer clado, la prevalencia de secuencias de Clostridiales pertenecientes al género Faecalibacteria y Subdoligranula fue sustancialmente menor en CIE (0,4%), en comparación con Saludable (15%, p=0,038) y CCD (26%, p=0,0012).

El análisis de las bibliotecas de clones de ADNr 16S para detectar posibles efectos de confusión del consumo de antibióticos mostró que el número de clones de Enterobacteriaceae (principalmente secuencias que se asemejan a E. coli/Shigella, clado 1) y Clostridiales (incluido el clado 3 de Faecalibacteria) en bibliotecas construidas a partir de pacientes con DCI y DCC se segregaron según el estado de la enfermedad, en lugar de la utilización de antibióticos (Figura suplementaria 2).

Para abordar la posibilidad de que las bacterias patógenas relacionadas con la enfermedad de Crohn por investigadores anteriores estuvieran presentes en las biopsias de mucosa a niveles que pueden haber impedido su inclusión en las bibliotecas de ADNr 16S, amplificamos muestras de mucosa por PCR con cebadores específicos para MAP y Listeria. Todas las muestras de mucosa fueron negativas.

Las enterobacterias asociadas a la mucosa y E. coli están aumentadas en la ileítis de Crohn in situ y se correlacionan con la actividad de la enfermedad

Sobre la base del análisis de la secuencia 16S, utilizamos FISH con sondas de oligonucleótidos contra un subconjunto de Enterobacteriaceae (1531), E. coli/Shigella (E. coli) y bacterias en general (EUB338), para examinar la distribución espacial de bacterias intactas asociadas a la mucosa. Varias bacterias (EUB338) se visualizaron predominantemente en el moco superficial que cubre una vellosidad, y fueron menos numerosas en el DAI que en el CCD (Figura 3, p=0,0078). Por el contrario, la mucosa de la DAI contenía significativamente más Enterobacteriaceae (8,7% de las bacterias de la mucosa) y E. coli (3,5% de las bacterias de la mucosa) que la mucosa ileal normal (menos del 0,2% de las bacterias de la mucosa eran Enterobacteriaceae o E. coli) (Figura 3). E. coli fue más numerosa en las regiones inflamadas y erosionadas, observándose E. coli intramucosa en 4/12 DAI, pero no en Sano ni en CCD (Figura 3). El número de E. coli determinado por FISH se correlacionó con los resultados de la PCR cuantitativa del ADN de la mucosa para E. coli uidA (ρ 0,549, P=0,0037). No hubo correlación entre los recuentos bacterianos totales y la PCR cuantitativa para E. coli (ρ 0,008, p = 0,967). En la Figura complementaria 3 se muestran imágenes adicionales de FISH.

Figura 3

Análisis in situ de la flora asociada a la mucosa ileal. Se utilizó hibridación in situ (FISH) con sondas de oligonucleótidos contra un subconjunto de Enterobacteriaceae (1531, 23srRNA), E. coli/Shigella (16srRNA) y bacterias en general (EUB338) para examinar el número y la distribución espacial de bacterias intactas dentro de la mucosa ileal de individuos sanos (Healthy), y pacientes con CCD y ICD. (a) Las bacterias totales (Eub 338) fueron más numerosas en la mucosa ileal de la DCC que en la DAI (p = 0,0078). Bar = mediana. (b) Las enterobacterias (1531) fueron más numerosas en la mucosa del DCI (8,7% de las bacterias de la mucosa) que en la mucosa ileal sana (menos del 0,2% de las bacterias de la mucosa eran enterobacterias: p = 0,0274). Bar = mediana. (c) E. coli fue más numerosa en la mucosa del DAI (3,5% de las bacterias de la mucosa) que en la mucosa ileal de las bacterias sanas (p = 0,0289) y CCD (p = 0,0318). Bar = mediana. (d) El FISH con sonda FAM-EUB338 (verde) muestra que las bacterias en la mucosa ileal normal se localizan predominantemente en el moco superficial que cubre una vellosidad. ADN teñido con DAPI (azul). Las bacterias miden de 2 a 3 μ de largo, el aumento original × 600. (e) FISH con Cy3-Enterobacteriaceae-1531 (rojo) y FAM-EUB338 (verde) muestra una población mixta de Enterobacteriaceae (naranja/amarillo) y otras bacterias (verde) en la superficie mucosa. ADN teñido con DAPI (azul). Las bacterias miden de 2 a 3 μ de largo, el aumento original × 600. (f) FISH con Cy3-E. coli/Shigella (rojo) y FAM-EUB338 (verde) muestra E. coli (naranja/amarillo) sobre y dentro de la mucosa ileal erosionada. Se observaron E. coli intramucosas en 4/12 DAI, pero estuvieron ausentes en Healthy y CCD. ADN teñido con DAPI (azul). Las bacterias miden de 2 a 3 μ de largo, el aumento original es de 600 ×. CCD, enfermedad de Crohn restringida al colon; DAPI, 4,6-diamidino-2-fenilindol; FISH: hibridación fluorescente in situ; DCI: enfermedad de Crohn ileal.

Para investigar la relación de las bacterias de la mucosa con el DAI se determinó la correlación entre el número de bacterias visualizadas por FISH y las puntuaciones endoscópicas e histológicas de la actividad de la enfermedad ileal. El número de enterobacterias mucosas (1531) y E. coli visualizadas por FISH se correlacionó con la severidad de la ileítis determinada por endoscopia (1531 ρ 0,524, P=0,005: E. coli ρ 0,617, P=0,0006) e histología (1531 ρ 0,552, P=0,0028: E. coli ρ 0,621, P=0,0006). Por el contrario, hubo una correlación negativa significativa entre la actividad endoscópica de la enfermedad y el número total de bacterias asociadas a la mucosa observadas en una sección (EUB ρ −0,474, p = 0,0349).

Las E. coli ileales son genéticamente diversas, pertenecen a nuevos grupos clonales y carecen de genes de virulencia comunes de E. coli diarreicas

Para determinar si las E. coli asociadas con el DAI pertenecen a un conglomerado distinto restringido a la enfermedad, examinamos 205 colonias individuales de E. coli cultivadas a partir de homogeneizados de la mucosa ileal de DAI (110 colonias del 61,5% de los pacientes), CCD (70 colonias del 62,5% de los pacientes) y Healthy (25 colonias del 28,5% de los pacientes) para determinar la diversidad genética general y el filogrupo (A, B1, B2, D), mediante RAPD- y triplex-PCR, respectivamente. Los resultados completos del cultivo de mucosas se proporcionan en la Figura 4. Este enfoque consolidó la colección de 205 aislamientos en un grupo de 22 cepas representativas: 12 cepas de ocho pacientes con DCI, ocho de cinco pacientes con DCC y dos de dos individuos sanos.

Figura 4

Cultivo microbiano de mucosa ileal. Se cultivaron homogeneizados de mucosas del íleon de individuos sanos, CCD e ileítis de Crohn (DAI) en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Los resultados se expresan como % de cultivos positivos en un grupo. G (−)=Gram negativo; G (+)=Gram positivo. CCD, enfermedad de Crohn restringida al colon; DCI: enfermedad de Crohn ileal.

A continuación, se realizó una RAPD-PCR adicional, serotipificación, MLST de siete genes de mantenimiento y PCR para detectar la presencia de genes comúnmente asociados con E. coli diarreicogénica (Tabla 1). Los patrones de anillamiento generados por RAPD-PCR fueron únicos para 20 de las 22 cepas, lo que indica la diversidad genética general de la población (Figura 5). Dos cepas de diferentes pacientes (576-1, 578-1) eran idénticas en el patrón y el serotipo de RAPD, y pertenecían al filogrupo D. Curiosamente, MLST indicó que 15 de las 22 cepas, independientemente de su asociación con la enfermedad, pertenecían a nuevos grupos clonales. No se encontró evidencia de un filogrupo o serotipo dominante asociado a la enfermedad, y de los genes de virulencia comúnmente asociados con E. coli diarreica, solo stx y eae estuvieron presentes en cuatro cepas (Tabla 1). Las adhesinas asociadas a E. coli patógena extraintestinal y APEC (ibeA y papC) estuvieron presentes en dos y cuatro cepas respectivamente (Tabla 1).

Tabla 1

Caracterización de cepas de Escherichia coli aisladas de la mucosa ileal de controles sanos, CCD y DAI

Fuente	Identificación del paciente	Colar	Serotipo	Filogrupo	MLSTaST7:CG	Genes de virulenciab
Sano	470	470-1	O1:H12	D	N:0	afa, colV
	601	601-1	O-:H30	B1	230:39	Stx1, hcp
CCD	524	524-2	O(140,85):H36	B1	N:0	Profesional de la salud
		524-6	O(R):H32	Un	N:0	colV, hcp
	355	355-1	O86:H18	D	N:0	EAE, HCP
		355-5	O43:H−	B1	N:0	Profesional de la salud
	568	568-2	O7:H+	D	N:0	—
		568-3	O25:H4	B2	34:0	colV
	584	584-1	O132: H2/35	Un	171:23	eae, papC, hcp
	467	467-1	O21:H+	Un	N:0	colV, papC, hcp
ICD	C532	532-9	O4:H56	B2	28:38	ratA, colV
	C541	541-P6	O8:H23	B1	N:0	colV
		541-P10	O8:H36	D	N:0	ibeA, colV
		541-1	O-:H18	B1	N:0	Profesional de la salud
		541-15	O21:H33	Un	N:0	Profesional de la salud
	c552	552-P4	O116: H9	Un	171:23	ratA, hcp
		552-2	O(23 o 73):H28	B1	160:21	Profesional de la salud
	546	546-1	O-:H(6 o 41)	B2	23:7	eae, ibeA, ratA, colV
	576	576-1	O(73 o 77):H18	D	N:0	papC, ratA
	603	603-1	O39:H11	Un	N:0	—
	578	578-1	O(73 o 77):H18	D	N:0	papC, ratA
	75	75	O39:H10	Un	171:23	Profesional de la salud

un

Abreviaturas: CCD, enfermedad de Crohn restringida al colon; CG: grupo clonal; CG0: grupo clonal indefinido; FISH: hibridación fluorescente in situ; DAI: enfermedad de Crohn ileal; MLST, tipo de secuencia multilocus; N, nuevo tipo de secuencia; ST7, tipo de secuencia basada en siete genes aspC, clpX, fadD, icdA, lysP, mdh y uidA.

b

Se realizó PCR para los siguientes factores de virulencia: toxina termolábil (LT) de E. coli, toxinas termoestables (STa y STb), toxinas similares a Shiga (SLTI y SLTII), factores necrotizantes citotóxicos (CNF-1 y CNF-2), la variante γ del gen que codifica la intimina (eae), ibeA, papC, afaB-afaC, sfaD-sfaE, focG, ratA, ColV, hcp, pMT1.

c

E. coli intramucosa visualizada por FISH.

Figura 5

Evaluación de la diversidad genética mediante RAPD-PCR. Las cepas con diferentes patrones de bandeo son distintas en el genotipo general. Dos grupos de dos cepas fueron similares con el cebador RAPD 1283 (524-2 y 541-15, 576-1 y 578-1). Cuando se evaluaron con el cebador RAPD 1254, las cepas 576-1 y 578-1 fueron similares en genotipo general (ambas son cepas D y comparten el serotipo O73 o 77:H18), mientras que las cepas 524-2 y 541-15 fueron diferentes en genotipo y serotipo general. RAPD-PCR, PCR-PCR de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente.

Las E. coli del íleon sano e inflamado invaden y persisten dentro de las células epiteliales y se replican en los macrófagos in vitro

Para investigar la virulencia potencial de cepas de E. coli aisladas de la mucosa del DCI, estudiamos la capacidad de nuestras 22 cepas ileales de E. coli para invadir las células epiteliales intestinales (Caco-2) y replicarse dentro de los macrófagos (J774) in vitro. Como controles se utilizó una cepa no patógena de E. coli (DH5α) y una cepa LF82, que se aisló de un paciente con DAI en Francia (LF82) y muestra un comportamiento “adherente e invasivo” en células cultivadas (Boudeau et al., 1999). Cuatro cepas con genes de virulencia conocidos (601-1, 355-1, 584-1, 546-1), y una cepa que tenía resistencia intermedia a la gentamicina (467-1), se excluyeron de los ensayos de cultivo. De las 17 cepas restantes, 10 invadieron células epiteliales en un grado similar al de LF82 (Figura 6a). La invasión epitelial se redujo entre un 63% y un 99% por el inhibidor de microfilamentos citocalasina D, y entre un 22% y un 94% por el inhibidor de microtúbulos colchicina, lo que indica la implicación del citoesqueleto de la célula huésped en el proceso de invasión (Figura 6b). Quince cepas persistieron en las células epiteliales de manera más efectiva que E. coli DH5α (Figura 6c). Trece cepas fueron capaces de replicarse en macrófagos J774 (Figura 6d). Una proporción similar de cepas de la mucosa normal y del DAI invadieron o persistieron dentro de las células epiteliales o se replicaron en los macrófagos (Figuras 6a-d). Las cepas con capacidad para invadir las células epiteliales y replicarse en los macrófagos se aislaron con frecuencias similares de pacientes con DAI (38,5%), DCC (37,5%) y sanos (14,3%). La capacidad de invadir y persistir en las células cultivadas fue independiente del filogrupo, como lo ilustran las cepas del filogrupo A que mostraron los niveles más bajos y más altos de invasión.

Figura 6

Caracterización de E. coli ileal en células epiteliales intestinales cultivadas y macrófagos. Las barras en los gráficos representan la media±s.e. El origen (Healthy, ICD, CCD, control) y el número de cepa individual se muestran en el eje x. La cepa control LF82 se aisló de la mucosa ileal de un paciente francés con DCI, y es la cepa prototipo de un grupo conocido como E. coli adherente e invasiva (AIEC). a) Invasión de células epiteliales intestinales de Caco-2 cultivadas por cepas ileales de E. coli y controles. (b) Influencia de la citocalasina D (inhibidor de microfilamentos, barras grises) y la colchicina (inhibidor de microtúbulos, barras negras) en la invasión de células epiteliales intestinales cultivadas de Caco-2. c) Persistencia en células epiteliales intestinales Caco-2 cultivadas. (d) Persistencia y replicación en macrófagos J774. Los valores >100% son coherentes con la replicación. AIEC, adherente e invasiva E. coli; CCD, enfermedad de Crohn restringida al colon; DAI: enfermedad de Crohn ileal; s.e., error estándar de la media.

La sustracción del genoma revela homología con E. coli patógena extraintestinal y Enterobacteriaceae patógena

Para obtener información adicional sobre la filogenia y la virulencia de E. coli con un patotipo adherente e invasivo (AIEC) en células cultivadas, realizamos la sustracción del genoma de tres cepas de diferentes filogrupos: dos cepas aisladas de un paciente con E. coli invasiva observada in situ (541-1 B1, 541-15 A) y el prototipo de cepa AIEC LF82 (B2). La hibridación sustractiva supresora utilizando el genoma comensal secuenciado de E. coli MG1655 como controlador produjo 115 fragmentos genómicos con homología a genes que estaban ausentes en MG1655. Cincuenta y un fragmentos mostraron homología con genes descritos en E. coli patógena (Tabla Suplementaria 3). Treinta y seis genes más estrechamente parecidos en E. coli uropatógena (UPEC) y patógena aviar (APEC), y representaron al menos la mitad de los genes de E. coli aislados de cada cepa. Los 64 fragmentos genómicos que contenían secuencias no relacionadas con E. coli incluyeron 21 con mayor homología a enterobacterias patógenas como Salmonella (10), Yersinia (6), Shigella (3) y Klebsiella (2) (Tabla suplementaria 4).

Cuando se examinaron por función, 69 de los 115 fragmentos genómicos, que representan aproximadamente el 50% de los fragmentos de cada cepa, codificaron proteínas putativas, hipotéticas o novedosas de función aún desconocida. De los fragmentos con homología a genes conocidos, un fragmento parecido a ratA en Salmonella typhimurium que se asocia con la colonización del ciego y los parches de Peyer (Kingsley et al., 2003), y otro que se asemeja a una proteína corregulada de hemolisina (hcp) asociada con virulencia en Vibrio (Pukatzki et al., 2006), se consideraron potencialmente relevantes para la enfermedad. Se detectaron trece secuencias de fagos o plásmidos. En la cepa LF82 estaban presentes secuencias parecidas a plásmidos asociados con virulencia en Yersinia pestis (pMT1) y APEC (ColV), y esto se confirmó mediante el aislamiento y secuenciación parcial de un plásmido similar a pMT1 (Tabla suplementaria 5). Para determinar si las secuencias de nucleótidos con homología a pMT1, ColV, ratA y hcp estaban asociadas con el DCI, o con un patotipo adherente e invasivo en células cultivadas, examinamos nuestra colección de 22 cepas mediante PCR. las secuencias similares a pMT1 se restringieron a LF82, mientras que hcp, ColV y ratA estuvieron presentes en 12, ocho y cinco cepas, respectivamente (Tabla 1). Curiosamente, la rata A se restringió a cepas adherentes e invasivas aisladas de la DCI, y estuvo ausente en el filogrupo B1, mientras que la hcp y la ColV se distribuyeron uniformemente en las cepas de la DCI y la CCD. La presencia de estas secuencias de nucleótidos en una cepa no se correlacionó con su comportamiento similar al de un patógeno en células cultivadas.

Discusión

La flora asociada a la mucosa se implica con frecuencia como un factor fundamental en el desarrollo de la enfermedad de Crohn, pero las características bacterianas específicas que impulsan la respuesta inflamatoria siguen siendo difíciles de alcanzar. La falta de éxito en la identificación de un patógeno específico o disbiosis relacionada con la enfermedad de Crohn puede reflejar una falta de consideración de la enfermedad de Crohn como un grupo de enfermedades relacionadas, pero distintas, con criterios de valoración similares, en lugar de una sola enfermedad (Hanauer, 2006; Sartor, 2006). En el presente estudio, utilizamos una combinación de análisis de biblioteca de ADNr 16S, PCR cuantitativa, FISH y análisis molecular de bacterias cultivadas, para caracterizar la flora asociada a la mucosa ileal de pacientes con enfermedad de Crohn e individuos sanos, y exploramos la posibilidad de que la flora de la mucosa ileal varíe según el fenotipo de la enfermedad de Crohn. Hemos demostrado que la flora mucosa ileal de los pacientes con DCI está enriquecida en un nuevo grupo de E. coli potencialmente patógena y relativamente reducida en un subconjunto de Clostridiales, en comparación con el íleon de individuos sanos y pacientes con DCC. Nuestros hallazgos establecen que la composición de la flora asociada a la mucosa ileal de los pacientes con enfermedad de Crohn varía según el fenotipo de la enfermedad y proporcionan una explicación racional para la mayor prevalencia de anticuerpos dirigidos contra la porina C de la membrana externa de E. coli (OmpC) y la flagelina en pacientes con DCI frente a DCC (Arnott et al., 2004; Targan et al., 2005). Las disminuciones relativas en un subconjunto de Clostridiales que detectamos en el DAI reflejan estudios recientes de heces y mucosa colónica de pacientes con EC, y sugieren que esta alteración puede ser una característica de la EC en general más que un fenotipo específico (Gophna et al., 2006; Manichanh et al., 2006; Martínez-Medina et al., 2006). Estos hallazgos en la enfermedad de Crohn contrastan con el número relativamente normal de clostridios asociados a la mucosa reportados en pacientes con colitis ulcerosa (Gophna et al., 2006). Los estudios que analizan las heces describen una disminución selectiva del grupo Clostridium leptum en la EC frente a una disminución de Clostridium coccoides en la colitis ulcerosa (Sokol et al., 2006).

En el presente estudio, se utilizó el análisis de bibliotecas de ADNr 16S con un enfoque estadístico recientemente desarrollado para la asignación de secuencias según su origen (Nightingale et al., 2006), y PCR cuantitativa, para guiar la selección de sondas de oligonucleótidos para FISH de la mucosa ileal. Utilizando una sonda de oligonucleótidos restringida a E. coli y Shigella, y excluyendo la presencia de Shigella de los tejidos mucosos por PCR, encontramos que E. coli representaba aproximadamente el 3,5% de la flora asociada a la mucosa EUB338 positiva y el 40% del subconjunto de Enterobacteriaceae reconocido por la sonda 1531 en pacientes con ileítis de Crohn. Estudios previos han elegido sondas FISH que se dirigen a la flora entérica y fecal en general y han inferido la presencia de E. coli sobre la base de la hibridación para la sonda 1531 (Kleessen et al., 2002; Mylonaki et al., 2005; Swidsinski et al., 2005), que no es específica para E. coli (Poulsen et al., 1994; Simpson et al., 2006). La relativa ausencia de secuencias de Bacteroides en las bibliotecas 16S de pacientes con ileítis de Crohn que observamos contrasta con los resultados de estudios previos basados en FISH que informan que Bacteroides es la especie predominante en la mucosa ileal de pacientes con enfermedad de Crohn (Kleessen et al., 2002; Swidsinski et al., 2005). Nuestra observación de que la invasión bacteriana se restringía a áreas de erosión o ulceración, y la tendencia a que el número de bacterias fuera menor en las mucosas inflamadas que en las sanas, se hace eco de estudios previos que utilizan la hibridación in situ (Kleessen et al., 2002; Swidsinski et al., 2002). No observamos la presencia de bacterias DAPI-positivas para FISH en secciones mucosas de pacientes que consumían ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) (Swidsinski et al., 2005). Curiosamente, este fenómeno parece ser más frecuente en las biopsias de pacientes con colitis ulcerosa (CU) (80%) que en aquellos con enfermedad de Crohn (EC) (25%) (Swidsinski et al., 2005), por lo que es posible que hayamos evitado este efecto centrándonos en pacientes con EC, y también tomando muestras del íleon en lugar del colon, donde el 5-ASA se metaboliza a su forma activa.

Nuestros hallazgos plantean la posibilidad de que la disbiosis regional de la flora asociada a la mucosa esté causalmente relacionada con la inflamación ileal en la enfermedad de Crohn. El aumento selectivo de E. coli y la correlación de E. coli, pero no la colonización bacteriana en general, con la actividad histológica y endoscópica de la enfermedad sugiere que estas bacterias podrían estar involucradas en el proceso inflamatorio. Esta noción está respaldada por el aislamiento de cepas de E. coli de la mucosa de la enfermedad de Crohn en los estudios actuales y anteriores que muestran un comportamiento similar al de un patógeno en células cultivadas (Darfeuille-Michaud et al., 2004; Martin et al., 2004). Estas cepas, denominadas “E. coli adherente e invasiva” (AIEC), se identificaron originalmente en pacientes con ileítis de Crohn en Francia y pueden persistir en macrófagos cultivados y promover la elaboración de citoquinas relevantes para la enfermedad, como el factor de necrosis tumoral α (TNFα) y la IL-8 (Boudeau et al., 1999; Glasser et al., 2001; Barnich y Darfeuille-Michaud, 2007). Este comportamiento puede explicar la presencia de antígenos y ADN de E. coli en granulomas de la enfermedad de Crohn (Ryan et al., 2004), y la reciente asociación de AIEC con colitis granulomatosa en perros bóxer (Simpson et al., 2006). En el presente estudio, aislamos cepas de AIEC del 38% de los pacientes con DCI, lo que es altamente consistente con el 36,4% de pacientes con DAI descrito por Darfeuille-Michaud et al. (2004).

La virulencia bacteriana suele estar regulada por genes que promueven la invasión o replicación de organismos en las células diana (Cossart y Sansonetti, 2004). Sin embargo, los genes de este tipo que están ausentes en E. coli comensal aún no se han identificado en cepas de AIEC (Boudeau et al., 2001; Darfeuille-Michaud et al., 2004; Martin et al., 2004; Simpson et al., 2006). La marcada heterogeneidad en el serotipo y el genotipo general que observamos coincide con el análisis previo del ribotipo (Masseret et al., 2001), e indica que los AIEC no son un solo clon virulento. El análisis de MLST proporcionó más información sobre la relación de AIEC con E. coli como especie, que reveló que más del 75% de las cepas de AIEC aisladas en el presente estudio son filogenéticamente distintas de las 679 cepas de E. coli patógenas y comensales en la base de datos de EcMLST. Mediante el uso de la detección de virulencia basada en PCR y la sustracción del genoma, descubrimos que las cepas de AIEC con secuencias únicas de MLST y antecedentes filogenéticos distintos (A, B1, B2) albergan elementos cromosómicos y episomales que son homólogos a los descritos en UPEC, APEC y enterobacterias patógenas como Salmonella y Yersinia. La detección de un plásmido parecido a pMT1 Yersinia pestis en la cepa LF82, pero no en otras cepas de AIEC, tiene implicaciones importantes, ya que LF82 ha sido considerada como el prototipo de cepa AIEC (Boudeau et al., 2001; Barnich y Darfeuille-Michaud, 2007). La posibilidad de que las cepas AIEC compartan determinantes patoadaptativos comunes de virulencia está respaldada por la presencia en múltiples cepas de secuencias de nucleótidos con homología a factores de virulencia en Salmonella Typhimurium (ratA), APEC (ColV), UPEC (papC), E. coli asociada a meningitis (ibeA) y Vibrio (hcp). También se han detectado secuencias de nucleótidos parecidas a ratA en APEC, E. coli asociada a meningitis y UPEC, y pueden estar relacionadas con el tropismo y la persistencia en el tracto intestinal (Schouler et al., 2004). Los plásmidos ColV son importantes para la virulencia en APEC y pueden conferir uverovirulencia a E. coli no patógena (Skyberg et al., 2006). En la actualidad, se sabe que IbeA, una adhesina originalmente asociada a E. coli asociada a la meningitis, está ampliamente distribuida en E. coli patógena extraintestinal y APEC y también está presente en AIEC LF82 (Rodríguez-Siek et al., 2005; Moulin-Schouleur et al., 2006; Simpson et al., 2006). El PapC, una adhesina asociada con pielonefritis, también está ampliamente distribuida en E. coli patógena extraintestinal y APEC (Rodríguez-Siek et al., 2005), y está presente en cepas invasivas de E. coli recuperadas de EC colónica (Martin et al., 2004). Nuestros hallazgos, junto con los resultados previos de la secuenciación de fimH y los perfiles genéticos de virulencia de LF82 y AIEC de perros bóxer (Boudeau et al., 2001; Simpson et al., 2006), sugieren que las AIEC son un nuevo grupo de E. coli patógenas extraintestinales asociadas con la inflamación intestinal crónica. Si bien el presente estudio no aborda el papel de las bacterias en la enfermedad colónica, cabe destacar queLa E. coli herente e invasiva se ha asociado con la colitis de Crohn y el cáncer de colon (Martin et al., 2004), y la E. coli de los grupos filogenéticos B2 y D (estos grupos contienen la mayor parte de la E. coli patógena extraintestinal) se ha relacionado recientemente con la inflamación del colon en pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (Kotlowski et al., 2007). El presente estudio refuerza el alto grado de diversidad de E. coli como especie y su propensión a adquirir ADN de organismos distantemente relacionados (Reid et al., 2000; Welch et al., 2002). La secuenciación del genoma ayudará a resolver si las cepas AIEC han adquirido determinantes de virulencia comunes en paralelo (Reid et al., 2000), o si han adoptado el enfoque de “mezcla y combinación” descrito para UPEC (Brzuszkiewicz et al., 2006), y ayudará en la identificación de genes candidatos adicionales asociados con la virulencia.

Si bien es tentador especular que los AIEC son patógenos en lugar de comensales inofensivos, su aislamiento de la mucosa sana e inflamada indica que la mera presencia de estas cepas es insuficiente para causar la enfermedad. El aumento del número de E. coli asociada a la mucosa e invasiva en relación con otras bacterias que observamos en pacientes con ileítis de Crohn sugiere que las AIEC son patógenos oportunistas que pueden explotar el entorno mucoso de un individuo susceptible a la enfermedad de Crohn, por ejemplo, la reducción de la producción de defensina y el retraso en el aclaramiento bacteriano asociado con polimorfismos en NOD2/CARD15 (Sartor, 2006; Wehkamp y Stange, 2006). Alternativamente, la proliferación de E. coli puede ser consecuencia del agotamiento de la flora normal como Faecalibacterium, o alteraciones en productos bacterianos como el butirato, que es importante para la salud colónica y la regeneración ileal (Pryde et al., 2002; Bartholome et al., 2004), o una combinación de estas posibilidades. La resolución de estos problemas puede proporcionar una visión única de la biología de la enfermedad de Crohn y oportunidades para la intervención terapéutica.

Concluimos que la mucosa ileal de los pacientes con enfermedad de Crohn que afecta al íleon alberga un mayor número de un grupo filogenéticamente nuevo de E. coli invasiva y relativamente menos Clostridiales que la mucosa ileal de los pacientes con DCC y de los individuos sanos. Nuestros hallazgos establecen que la disbiosis de la flora de la mucosa ileal se correlaciona con un fenotipo de DCI, y plantean la posibilidad de que un aumento selectivo de un nuevo grupo de E. coli invasora esté implicado en la etiopatogenia de la ileítis de Crohn. Sugieren que un enfoque integrado que tenga en cuenta la flora asociada a la mucosa de un individuo, además del fenotipo y el genotipo de la enfermedad, puede mejorar el resultado.